利用先進(jìn)的成像技術(shù)提高

斑馬魚胚胎分析的清晰度和速度

本文介紹了帶有THUNDER功能的 DM6 B 顯微鏡如何簡化轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎的篩選，解決傳統(tǒng)顯微鏡分辨率低和焦外模糊的常見問題。高速成像、增強(qiáng)的對比度以及對低蛋白表達(dá)成像的靈敏度，確保了準(zhǔn)確高效的篩選。其主要功能包括即時計(jì)算清除、高靈敏度攝像頭和定向照明，是發(fā)育生物學(xué)的理想之選。

篩選轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎

轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎是發(fā)育生物學(xué)中常用的模式生物 [1]。這些樣本通常被設(shè)計(jì)用于體內(nèi)容積成像，使用需要特定樣本制備的系統(tǒng)，包括光片顯微鏡 [2]。因此，需要一種快速準(zhǔn)確的篩選技術(shù)來確定斑馬魚下游光片顯微鏡成像是否存在適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)表達(dá)。

斑馬魚篩選通常使用具有熒光成像功能的體視顯微鏡進(jìn)行。然而，體視顯微鏡的局限性在于分辨率和靈敏度較低，這在表達(dá)量較低的樣本中尤為重要。傳統(tǒng)的寬場顯微鏡是一種高速成像技術(shù)，但也存在焦外模糊的問題，尤其是對于包括斑馬魚胚胎在內(nèi)的較厚樣本。這種失焦模糊降低了對比度，而對比度對于斑馬魚的表達(dá)可視化至關(guān)重要。

配備 THUNDER 的 DM6 B 顯微鏡是一種用戶友好型系統(tǒng)，可通過它進(jìn)行高速篩選：

• ?采用新型SynapseTM 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)高速觸發(fā)；

• ?采用 8 通道 LED 光源，提供柔和而有針對性的照明；

• ?利用高靈敏度 K8 相機(jī)檢測低表達(dá)蛋白；

• ?通過 LAS X Navigator 螺旋掃描快速概覽掃描，找到最佳轉(zhuǎn)基因斑馬魚；

• THUNDER ICC（實(shí)時即時圖像增強(qiáng)功能）可提高對比度，清晰顯示熒光蛋白。
  
  
  

  圖 1：THUNDER Imager Tissue 用于篩選轉(zhuǎn)基因斑馬魚。
  圖像由澳大利亞莫納什大學(xué)（Monash University）莫納什生物醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)研究所博士生 Laura Kreplin 提供。

  材料和方法

  在此工作流程中，轉(zhuǎn)基因斑馬魚被轉(zhuǎn)移到 35 毫米的培養(yǎng)皿中。不過，也有與THUNDER成像系統(tǒng)組織兼容的其他安裝平臺。

  使用低倍物鏡定位培養(yǎng)皿中的斑馬魚胚胎（圖 2）。

  LAS-X Navigator用于標(biāo)記斑馬魚感興趣的區(qū)域（圖 3）。

  使用分辨率更高的物鏡來確定表達(dá)量是否足以進(jìn)行下游成像。此類物鏡包括 HC FLUOTAR L 16x/0,60 IMM CORR VISIR (506533)、HC APO L 63x/0,90 W U-V-I (506148) 和 HC FLUOTAR L 25x/0,95 W VISIR (506374)。低 LED 光強(qiáng)度、K8 Scientific CMOS 攝像機(jī) 95% 的峰值 QE 和實(shí)時觸發(fā)相結(jié)合，確保在篩選過程中保留內(nèi)源水平的蛋白質(zhì)信號（圖 4）。
  
  
  
  

圖 2：使用 THUNDER Imager Tissue 上的 1.25x/0.04 干式物鏡拍攝的斑馬魚胚胎明場圖像。比例尺為 1500 µm。
圖像由澳大利亞墨爾本莫納什大學(xué)（Monash University）莫納什生物醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)研究所 Dr. Senthil Arumugam 和博士生 Laura Kreplin 提供。

圖 3：使用 LAS X Navigator 發(fā)現(xiàn)的斑馬魚胚胎，并標(biāo)記用于熒光篩選。

圖像由澳大利亞墨爾本莫納什大學(xué)（Monash University）莫納什生物醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)研究所 Dr. Senthil Arumugam 和博士生 Laura Kreplin 提供。

圖 4：
A) 使用 16x/0.6 浸沒式下浸物鏡的 THUNDER Imager Tissue 配置。
B) 采用 THUNDER 實(shí)時即時計(jì)算清除成像（live instant computational clearing）獲得的斑馬魚胚胎圖像。成像 mKate 表達(dá)時，使用 LED 8 的 555 nm 激發(fā)線，在 2% 激發(fā)強(qiáng)度和 150 ms 曝光時間下獲取圖像。比例尺為 300 µm。
圖像由澳大利亞墨爾本莫納什大學(xué)（Monash University）莫納什生物醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)研究所 Dr. Senthil Arumugam 和博士生 Laura Kreplin 提供。

結(jié)論：

選擇具有適當(dāng)轉(zhuǎn)基因能力的斑馬魚胚胎進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)，包括光片成像。DM6 B 配備了THUNDER技術(shù)，具有高速成像能力，而且對比度和靈敏度都有所提高，可用于成像低表達(dá)蛋白，有助于確保篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性和高效性。這項(xiàng)研究表明，DM6 B 和THUNDER技術(shù)可以幫助人們更好地理解發(fā)育生物學(xué)和其他相關(guān)領(lǐng)域的現(xiàn)象。

參考文獻(xiàn)：

1. Veldman, M. B.; Lin, S. 《斑馬魚作為兒科研究的發(fā)育模式生物》。兒科研究》，2008 年，64（5），470-476 頁。

2. Oates, A. C.; Naganathan, S. R. 從斑馬魚胚胎制備單節(jié)段外植體。JoVE 2022，第184期，e63196。

3. YouTube 采訪莫納什生物醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)研究所：研究生命系統(tǒng)& 利用顯微鏡觀察動態(tài)過程

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